Cytoplasmatische Vektoren zur heterologen Genexpression bei Hefen

Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente zeigen, daß sich die cytoplasmatisch lokalisierten, linearen Killerplasmide der Hefe Kluyveromyces lactis prinzipiell zur Etablierung eines kernunabhängigen Expressionssystems eignen. Mit den konstruierten, linearen Hybridplasmiden konnte beispielhaft die Expression von drei biotechnologisch relevanten Proteinen, der Glucose-Dehydrogenase A aus Bacillus megaterium, der Uridindiphospho-Glucose-Dehydrogenase aus Streptococcus pyogenes und der Xylose-Isomerase aus Streptonryces rubiginosus, unter Kontrolle des cytoplasmatischen Transkriptionsapparats gezeigt werden. Für die Glucose-Dehydrogenase A erwies sich dabei ein willkürlich vor das heterologe Gen kloniertes, 97 Basenpaare großes Sequenzmotiv - das das cytoplasmatische Promotorelement UCS5 enthält - als ausreichend um eine meßbare Expression in der rekombinanten Hefe zu ermöglichen. Auch bei der Expression der Uridindiphospho-Glucose-Dehydrogenase in K. lactis wurde eine geringere spezifische Aktivität des Enzyms relativ zu der in einem bakteriellen System bestimmt. Der Nachweis der, durch ein Hybridplasmid kodierten, biologisch aktiven Xylose-Isomerase verdeutlicht, daß auch hoch G/C-reiche Gensequenzen (71% G/C) mit den linearen Killerplasmiden (die selbst mit 27% einen nur geringen G/C-Gehalt aufweisen) als Vektorsystem exprimiert werden können. Durch die in dieser Arbeit gezeigte hohe Stabilität der rekombinanten Plasmide auch ohne Selektionsdruck, sowie durch die Möglichkeit, diese linearen Hybridvektoren auf andere Hefen (wie z. B. Saccharvmyces cerevisiae ) zu übertragen, ist das etablierte Expressionssystem trotz seiner geringen Expressionseffizienz nicht nur für biotechnologische Produktionszwecke interessant, sondern könnte auch bei der Bearbeitung grundlegender Fragestellungen zur Genexpression in Hefen von Nutzen sein.