Substrat-Translokation im 20S-Proteasom aus Thermoplasma acidophilum

Das 20S Proteasom ist ein etwa 700 kDa schwerer multikatalytische Proteasekomplex von 700 kDa, der in allen drei Königreichen des Lebens vertreten ist. In Eukaryonten bildet dieser Komplex zusammen mit den 19S Kappenkomplexen das 26S Protesom, welches eines der Elemente des ATP-abhängigen Ubiquitin-Proteasom-Systems ist. Der Eingang des 20S Proteasoms ist durch eine Pore mit einem Durchmesser von 1,3 nm begrenzt, deren Durchlässigkeit als geschwindkeitsbestimmender Schritt der Substrattranslokation im 20S Proteasom betrachtet wird. Obwohl der Mechanismus der Porenöffnung durch ein regulatorisches Partikel aufgeklärt worden ist, ist über die Substratverteilung im Inneren des 20S Proteasoms nur wenig bekannt. Um einen besseren Einblick in diese zu bekommen, wurden hier fluoreszenz-markierte Host- Guest-Komplexe für Einzelmolekülanalysen sowie α-Synuclein-20S Proteasom Hybridproteine mit unterschiedlich langen Synuclein-Fragmenten für NMR Untersuchungen hergestellt. Diese sollten im Weiteren in Kooperationen untersucht werden. Auch die Auswirkungen einer möglicherweise dynamischen Verschiebung der α-Unterheiten bei Bindung des regulatorischen Komplexes sind bisher schlecht verstanden. Eine solche Verschiebung setzt eine Flexibiltät der Untereinheiten voraus und induziert wahrscheinlich Änderungen auf Kontaktflächen zwischen den Untereinheiten. Um den Einfluß einer Erhöhung der strukturellen Flexibilität auf den Substratumsatz zu untersuchen, wurde eine umfangreiche Mutationsanalyse durchgeführt. Zur Erhöhung der strukturellen Flexiblität wurden überwiegend Punktmutationen eingeführt, und zwar an den α-α und α-β Kontaktflächen oder in deren Nähe. Die proteolytische Aktivität wurde mit verschiedenen Substraten untersucht. Für bestimmt Mutationen der α-Untereinheiten wurde ein signifikant größerer Casein-Umsatz gemessen als für den wt. Dies könnte ein Hinweis auf eine zusätzliche Poren-unabhängige Aktivierung des 20S Proteasoms bei Bindung des regulatorischen Partikels durch Unterbrechung von Wasserstoffbrücken sein. Ein anderer Ansatz bestand darin, die Flexiblität der Kontaktflächen durch kovalente Vernetzung zu verringern. Hierzu wurden gezielt Cysteinmutationen zwecks Bildung von Disulfidbrücken eingeführt. Zwar gelang es nicht die angestrebte Versteifung zu demonstrieren, im Zuge der Mutationsstudien wurde jedoch entdeckt, dass bestimmte Punktmutationen der β- Untereinheiten das Proteasom strukturell destablisieren und gleichzeitig inaktivieren. Anscheinend reichen subtile strukturelle Veränderungen an den β-β Grenzflächen aus, um das aktive Zentrum in eine inaktive Konformation zu versetzen.